52, No. 固定化の目的 免疫組織化学における固定化には、次の4つの目的があります。 細胞の形態や組織の構造を安定化 タンパク質分解酵素の不活化 加工や染色処理に対するサンプルの強化 微生物のコンタミネーションや腐蝕を抑制 生検筋の固定 生検筋の凍結固定方法（組織化学染色および免疫組織化学染色用）およびグルタールアルデヒド固定方法（電子顕微鏡観察用）を示すビデオです。特別な理由がない限り生検筋がフォルマリン固定されることはありません。 電子顕微鏡用の標本固定に用いる． 形態保持の点でホルマリンより優れているが，浸透性・染色性に劣る． 小さい組織片とする．固定は低温（4 ）で行う． ** 3) ピクリン酸固定 ピクリン酸 picric acid 固定は架橋と凝固の両方の 電子顕微鏡法の発明以来，生物学に重大な知見を与え た事例は多い．2016年ノーベル医学生理学賞である大隅 博士の「オートファジーの仕組みの解明」の研究も，ま た，固定した細胞の切片を観察した電子顕微鏡 … 試料の種類や状態、観察目的、使用する電子顕微鏡の機能や性能によって、固定や樹脂包埋、切片作製など、この中から最適な方法を選択します。 固定とは化学固定と物理固定に大別されます ( 物理固定に関しては →高圧凍結技法の詳細 をご覧ください ) 。 はじめに 免疫電子顕微鏡（免疫電顕）法は，抗原抗体反応を利用し て目的とする抗原の局在を，電子顕微鏡（電顕）下で識別可 能な標識でラベルした抗体を用いて検出する方法である．蛍 また、従来のCLEMでは、蛍光観察の後に、電子顕微鏡用の化学固定処理・超薄切片調製を行う過程で化学的・物理的歪みが生じてしまうため、高精度の画像の重ね合わせによる解析を行うことは困難でした（図1）。そこで研究グループ 化学固定と凍結固定によるトレポキシア藻Chloz.elJa vulgarL'Sの電子顕微鏡観察 55 図1 Ch/ore//a vu/gan'Sの化学固定像と凍結固定像 a,bはグルタール･オスミウム二重固定像､ C,dは過マンガン酸･オスミウム二重固定像､ e,fは しかし食品分野での電子顕微鏡の活用方法は、今日でも化学固定法、超薄切片 法などの伝統的な観察方法が多い傾向にある。そこで本研究では、食品分野で の活用例がほとんどないクライオ電子顕微鏡法に着目した乳および乳製品の微 電子顕微鏡用試料の前処理では、化学固定や脱水、置換の過程で細胞の微細構造が変化したり、可溶性成分が流出するなど、アーティファクトの出現が問題とされてきました。その解決策として提唱されているのが、凍結固定法です。微細 2 （2017） 1. 固定，低加速電圧走査電子顕微鏡法，無コ ー テ a ソ グ 試料 の 直接観察，酵母細胞，細胞膜内タ ン パ ク質粒子．〕 凍結置換固定法に よ る走査 ・透過電子顕微鏡観察 1．サ ン ドイ ッ チ方式 に よる凍結置換固定法1・2｝ 培養 した 前処理・化学固定の必要性について まず初めに理解しておくべきこととは、電子顕微鏡観察においては試料を 真空の中へ入れる ということです。真空とは、空気の無い空間です。水分などはどんどん蒸発し … 対象試料に電子を当てて、それを透過してきた電子が作り出す像を観察する電子顕微鏡。そのため、生物試料では化学固定したものをプラスチック系の溶剤に包埋・固化したのち、できるだけ薄く切り出して観察することが多い。重金属などを 98 顕微鏡 Vol. 走査型電子顕微鏡(SEM)を用いた 生物試料の観察 自然研究講座 細胞分化研究室 出野 卓也 0．はじめに このテキストでは、走査型電子顕微鏡の 原理を簡単に説明した上で、生物試料の基 本的な処理方法につ … 電子顕微鏡は物理や化学、生物から医学部門と大変幅広い分野に利用されています。 電子顕微鏡の歴史は20 世紀初頭にまで遡ります。最初の電子顕微鏡は1932 年にドイツで開発されました。開発者はこの功績で後年「ノーベル物理学 はじめに 生物表面の微細構造の観察／解析には，走査型電子顕微鏡 が有効な機器として用いられて来た．しかし，高倍率・高分 解能で表面微細構造を観察できる電界放出型走査電子顕微鏡 ここでは化学固定剤(グルタルアルデヒド・ホルムアルデヒド・四酸化オスミウム)と試料の間の固定機序についてお話します。 「微生物の電子顕微鏡観察」 小川 みどり 先生（産業医科大学 医学部 微生物学） 西村 伸一郎 先生（KM 0 透過電子顕微鏡用試料作製法と問題点 （非生物試料編） 1．透過電子顕微鏡TEM用試料の特徴 （1）加速電圧と試料の厚さ（透過能） （2）TEM 用試料に必要な条件 2．観察目的とTEM 用試料 3．形態観察-レプリカ法 また、従来のCLEMでは、蛍光観察の後に、電子顕微鏡用の化学固定処理・超薄切片調製を行う過程で化学的・物理的歪みが生じてしまうため、高精度の画像の重ね合わせによる解析を行うことは困難でした（図1）。そこで研究グループ 電子線トモグラフィーにおいて観察された分子が何であるのかを同定するのは 難しい。また、低温電子顕微鏡法は、化学固定や脱水の操作がなく、生きてい る時に近い状態で細胞内タンパク質を観察できる手法として注目されているが、 固定後は70 ％エタノールで溶液の黄色が消えるまでよく洗う。 4 ％ パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液 ・パラホルムアルデヒド・・・・・・・20 g ・0.1 mol/L りん酸緩衝液（pH7.4)・・500 mL 主に免疫組織化学用、電子顕微鏡検査用固定液とし 化学固定 その一般 酢 臨 5 グ 緩 蒸 乾燥 置換 脱水 洗浄 固定 洗浄 めに かびなどの微 多く含む生物 ためには、表 要となります には試料調製 す。そこで本 に用いる生物 します。 電子顕微鏡の 子顕微 pe, SEM） 子線を試料 から得 クライオ電子顕微鏡法ノーベル化学賞受賞記念コラムー原子レベルでのタンパク質構造解析が生化学を新しい時代に導いた ジャック・デュボシェ教授 スイス・ローザンヌ大学の生物物理学者。クライオ電子顕微鏡法を開発した。 1.2 化学固定法 3 1.2.1 緩衝液・固定液の作り方 3 1.2.2 前固定：浸漬固定と灌流固定 10 1.2.3 後固定 13 1.3 脱水 15 1.4 溶剤置換 16 1.5 包埋と重合 19 1.6 トリミングと薄切 20 1.6.1 試料確認用の簡単な準超簿 … 走査型電子顕微鏡（SEM）の試料作製法 ここでは、当センターで日常的に行われている試料作製法を掲載しております。 洗浄と試料摘出 試料表面にあるゴミや付着物はSEMによる表面観察に支障があるので、事前に取り除いておく。 化学固定とは?走査電子顕微鏡用語。 生物試料に対する固定法の一つ。細胞や組織中のタンパク質や脂質を、グルタ−ルアルデヒド、パラホルムアルデヒドあるいは四酸化オスミウムなどの固定剤を使って凝固させ、安定にする固定法。 2014/¸ 1.